Evidencia de los efectos beneficiosos de beber Agua hidrogenada (HW) – Hidrogen Water , de sus siglas en inglés.

Nuestro objetivo fue investigar los efectos del consumo de HW sobre el estrés oxidativo y las funciones inmunes en adultos sanos utilizando enfoques sistémicos de nutrición bioquímica, celular y molecular. En un estudio aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo, los adultos sanos (20 a 59 años) consumieron 1,5 L / d de HW ( n  = 20) o agua corriente (PW, n = 18) durante 4 semanas. Los cambios desde el inicio hasta la cuarta semana en el potencial antioxidante biológico (BAP) sérico, los derivados del oxígeno reactivo y la 8-Oxo-2′-desoxiguanosina no difirieron entre los grupos; sin embargo, en los ≥ 30 años, la BAP aumentó más en el grupo de HW que en el grupo de PW. La apoptosis de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fue significativamente menor en el grupo HW. El análisis de citometría de flujo de células CD4 ⁺ , CD8 ⁺ , CD20 ⁺ , CD14 ⁺ y CD11b ⁺ mostró que la frecuencia de CD14 ⁺las células disminuyeron en el grupo HW. El análisis de secuenciación de ARN de PBMC demostró que los transcriptomas del grupo HW se distinguían claramente de los del grupo PW. Más notablemente, las redes transcripcionales de respuestas inflamatorias y la señalización de NF-κB estaban significativamente reguladas a la baja en el grupo HW. Estos hallazgos sugieren que el HW aumenta la capacidad antioxidante, reduciendo así las respuestas inflamatorias en adultos sanos.

El estrés oxidativo indica un estado en el que el exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) sobrepasa la capacidad antioxidante biológica, lo que conduce a la interrupción de la homeostasis de las ROS y al daño celular ¹ . Es importante que las células mantengan niveles moderados de ROS para realizar funciones fisiológicas normales ² . Los niveles excesivos de ROS son responsables del daño oxidativo del ADN y los lípidos, lo que puede provocar la muerte celular ³ . Además, el estrés oxidativo puede provocar respuestas inflamatorias ^3 , 4.que puede mejorar aún más el estrés oxidativo. Como resultado, el estrés oxidativo puede actuar para precipitar la inflamación crónica, con condiciones patológicas que desencadenan diversos trastornos que incluyen enfermedades cardiovasculares, síndrome metabólico, trastornos neurodegenerativos y cáncer ^{5 , 6 , 7 , 8} .

No hay duda de que el estrés oxidativo juega un papel central en la patogénesis de diversas enfermedades crónicas. Como resultado, ha sido de creciente interés evaluar los efectos coadyuvantes de los agentes antioxidantes en los alimentos sobre la prevención y el alivio de estas enfermedades. Recientemente, la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos reconoció el gas hidrógeno (H ₂ ) como aditivo alimentario cuando se usa en agua potable o bebidas y los declaró generalmente reconocidos como seguros. H ₂ puede ser una novela antioxidante debido a su capacidad para eliminar selectivamente oxidantes fuertes tales como el radical hidroxilo ⁹ . En modelos de lesión por isquemia / reperfusión, el H ₂ previno el daño tisular y redujo el tamaño del infarto ^{10 , 11 , 12}. En modelos de rata de trastornos neurodegenerativos, incluidas las enfermedades de Parkinson y de Alzheimer, la administración de H ₂ mejoró la función de la memoria de ratas y retarda la progresión de la enfermedad ^13 , 14 . Algunos ensayos clínicos también han determinado el efecto del H ₂ en varias enfermedades, incluido el síndrome metabólico, la artritis reumatoide, la hepatitis B crónica y la enfermedad de Parkinson ^{15 , 16 , 17 , 18} .

A pesar de la creciente evidencia de que conste a los efectos beneficiosos de H ₂ , a nuestro entender, pocos estudios se han realizado en una población sana. Además, el efecto sistémico de H ₂ administración no ha sido dilucidado porque la mayoría de los estudios anteriores se han centrado únicamente en la medición de marcadores limitados. Aquí, nuestro objetivo fue investigar los efectos del consumo de agua rica en H ₂ (HW) en adultos sanos a través de análisis exhaustivos de la capacidad antioxidante, subconjuntos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y su perfil de transcriptoma y comparar los efectos del consumo de HW con los de consumo de agua corriente (PW).

Participantes y características basales

El diagrama de flujo de los participantes a lo largo del estudio se presenta en la figura  1 . Se evaluó la elegibilidad de un total de 158 participantes de acuerdo con los criterios de inclusión y exclusión. Se encontró que 41 participantes eran elegibles y se incluyeron en el estudio. Fueron asignados aleatoriamente al grupo PW ( n  = 19) o al grupo HW ( n  = 22). De los 3 participantes que se retiraron del estudio, 1 participante en el grupo PW abandonó antes de comenzar la intervención y 2 participantes en el grupo HW abandonaron el cuarto día y el décimo día. Como resultado, un total de 38 participantes completaron con éxito la intervención de 4 semanas y se incluyeron en el análisis final ( n  = 18 en el grupo PW; n = 20 en el grupo HW) (Fig.  1 ).

Diagrama de flujo de los participantes a lo largo del estudio.

Como se muestra en la Tabla 1 , no hubo diferencias estadísticas en la edad, la altura, el peso, el IMC y la ingesta diaria de agua corriente al inicio del estudio entre los grupos PW y HW (todos P  > 0.05).

El consumo de cuatro semanas de agua pura y agua rica en hidrógeno aumentó el potencial antioxidante biológico (BAP) sérico (Δ = 194.4 ± 315.4 μmol / L, P  <0.05 en PW; Δ = 297.8 ± 274.2 μmol / L, P  <0.001 en HW) (Tabla 2 ). Aunque no hubo diferencias significativas en la comparación entre grupos de PW versus HW en la población total ( P  = 0.267) (Tabla 2 ), los participantes que tenían más de 30 años mostraron un aumento significativo en BAP al beber agua rica en hidrógeno pero no agua pura, y la diferencia en los cambios fue significativa ( P  = 0,028) (Fig.  2). Por el contrario, no se encontró ningún efecto significativo del agua rica en hidrógeno sobre BAP en el grupo más joven (<30 años) ( P  = 0.534) (Fig.  2 ).

Cambios con respecto al valor inicial en la BAP sérica por edad (<30 años y ≥ 30 años). Los datos se presentan como medias ± SEM. Las diferencias significativas entre el valor inicial y la semana 4 dentro de cada grupo se determinaron con el uso de una prueba t pareada . Los valores de P se obtuvieron con el uso de análisis de efectos principales simples y P  <0,05 se consideró estadísticamente significativo. ( A ) Dentro de los participantes de <30 años, no hubo diferencias significativas entre el grupo PW ( n  = 10) y el grupo HW ( n  = 10) para el cambio en BAP ( P  = 0.534). ( B ) El grupo HW ≥ 30 años ( n  = 10) mostró un mayor aumento en BAP en comparación con el grupo SP ≥ 30 años (n  = 8) ( P  = 0,028). PW, agua corriente; HW, H ₂ agua rica en; BAP, potencial antioxidante biológico.

El estrés oxidativo en suero evaluado por el nivel de derivados del oxígeno reactivo (d-ROM) no se vio afectado por la intervención de 4 semanas (todos P  > 0,05) (Tabla 2 ). Los niveles de 8-Oxo-2′-desoxiguanosina (8-OHdG), un marcador de daño al ADN, disminuyeron significativamente en ambos grupos (Δ = – 0.94 ± 1.44 ng / mL, P  <0.05 en PW; Δ = – 1.32 ± 1.05 ng / mL, P  <0.001 en HW), pero sin diferencia estadística entre los grupos de PW y HW (todos P  > 0.05) (Tabla 2 ).

Apoptosis de PBMC y perfiles de población de células inmunes de la sangre

En la línea de base, no hubo diferencias significativas entre dos grupos en las frecuencias de células apoptóticas en la sangre ( P  = 0,606) (Fig.  3 ). Sin embargo, después de las 4 semanas de prueba, el grupo HW mostró un porcentaje significativamente menor de apoptosis de PBMC en comparación con el grupo PW ( P  = 0.036) (Fig.  3 ).

Datos citométricos de flujo representativos ( A ) y frecuencias de células apoptóticas (Anexina V ⁺ DAPI ⁺ ) al inicio y en la semana 4 ( B ). Los datos se presentan como medias ± SEM. Las diferencias significativas entre el grupo PW ( n  = 14) y el grupo HW ( n  = 15) al inicio del estudio se determinaron con el uso de una prueba t para datos no apareados o una prueba U de Mann-Whitney , y las de la semana 4 se determinaron con un modelo lineal general ajustando el valor en la línea de base como una covariable. PW, agua corriente; HW, H ₂ agua rica en.

Se perfilaron subconjuntos de PBMC con los anticuerpos específicos para marcadores de superficie celular, incluidos CD4, CD8, CD20, CD14 y CD11b. Los grupos PW y HW presentaron patrones similares de cambio en CD4 ⁺ (Δ = – 3.5 ± 4.8%, P  <0.01 en PW; Δ = – 2.4 ± 3.6%, P  <0.01 en HW), CD8 ⁺ (Δ = – 4.8 ± 2,1%, P  <0,001 en PW; Δ = – 4,5 ± 2,6%, P  <0,001 en HW) y células CD11b ⁺ (ambas P  > 0,05) (Tabla 3 ). Aunque la frecuencia de células CD20 ⁺ aumentó en el grupo HW en comparación con los valores basales (Δ = 1,5 ± 2,5% y P <0.05), no hubo diferencias significativas entre los grupos HW y PW ( P  = 0.900) (Tabla 3 ). Es notable que el cambio en la frecuencia de células CD14 ⁺ en el grupo HW fue significativamente diferente del cambio en el grupo PW ( P  = 0.039) (Tabla 3 ) .

Perfiles de transcriptomas de PBMC

Con el fin de dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales el consumo de agua rica en hidrógeno afecta la apoptosis y los perfiles de células inmunes de PBMC, se llevó a cabo un análisis de secuenciación de ARN en una escala de todo el genoma utilizando conjuntos totales de ARN de 6 individuos que incluían tres muestras seleccionadas al azar. por grupo. Se identificaron un total de 605 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) entre los grupos HW y PW como se describe en “ Métodos ”. Análisis de agrupamiento jerárquico mostró transcriptomes de HW eran fácilmente distinguibles de los de PW (Fig.  4A). Para obtener información sobre las implicaciones funcionales de los perfiles de expresión génica alterados causados ​​por el agua con hidrógeno, los DEG se categorizaron por funciones fisiológicas y se evaluó la importancia del enriquecimiento de cada categoría mediante la prueba exacta de Fisher. Curiosamente, los mejores 5 categorías importantes fueron la respuesta inflamatoria, el tráfico de células inmunitarias, el desarrollo del sistema hematológico y la función y las enfermedades infecciosas y enfermedades inmunológicas (Fig.  4B). Dentro de la categoría más significativa, la respuesta inflamatoria, fue de interés que los genes implicados en la señalización de TLR-NF-κB tuvieran una expresión muy reducida. Incluyeron una serie de receptores tipo toll y moléculas mediadoras clave como TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 y MYD88. Además, la transcripción de proteínas intracelulares implicadas en la señalización de NF-κB incluyendo NFKB1, NLRP12 y MAP3K1 y, por lo tanto, genes posteriores como FOS y RELB se redujeron significativamente en el grupo HW (Fig.  4 C). Además, investigamos los niveles de expresión de genes que responden a la activación de NF-κB y los que codifican citocinas proinflamatorias y sus receptores. En consecuencia, observamos que el grupo HW tenía niveles de expresión significativamente más bajos en IL1B, IL8, IL6R y TNFRSF10B que el grupo PW (Fig. 4 D).

Perfiles de transcriptoma de células mononucleares de sangre periférica en la semana 4. ( A ) Análisis de agrupamiento jerárquico de DEGs ( B ) Las 5 categorías funcionales biológicas principales fueron descubiertas dentro de DEG por IPA. La significación estadística se calculó mediante la prueba exacta de Fisher y se anotó como un logaritmo ( valor P ). ( C ) Los mapas de calor de los niveles de expresión de genes clave relacionados con el receptor tipo toll y el grupo de señalización NF-κB ( D ) HW ( n  = 3) presentaron los niveles de expresión más bajos en genes que responden a IL6R y NF-κB, incluidos IL1B, IL8 y TNFRSF10B , en comparación con el grupo PW ( n = 3). Los datos se presentan como medias ± SEM. Las diferencias significativas entre los grupos PW y HW se determinaron con el uso de una prueba t para datos no apareados . PW, agua corriente; HW, H ₂ agua rica en; DEG, genes expresados ​​diferencialmente; IPA, análisis de la vía del ingenio; RPKM, lecturas por millón de kilobase.

Los efectos de H ₂ rica en agua en el sistema antioxidante han sido probados en gran parte dentro de modelos in vitro o animales, con datos limitados en humanos a partir de unos estudios de pacientes que permiten fundamentación de los papeles beneficiosos del agua ^{19 , 20 , 21} . Hasta donde sabemos, este es el primer ensayo clínico aleatorizado que investiga las actividades antioxidantes del agua H ₂ en sujetos sanos, especialmente a través de un análisis exhaustivo de los marcadores de estrés oxidativo, los perfiles de las células inmunitarias de la sangre y la expresión génica a escala del genoma. El consumo de cuatro semanas de H ₂El agua indujo un aumento sustancial de la capacidad antioxidante y una disminución del estrés oxidativo de los ADN, aunque no se encontró significación en la comparación de un grupo de intervención ( agua H ₂ ) y el grupo placebo (agua pura). Estas observaciones de que el agua H ₂ mostraba cierto potencial para tener actividad antioxidante, nos llevó a examinar más a fondo el efecto sobre la apoptosis de las células sanguíneas periféricas en cada sujeto, ya que incluso pequeños cambios en el estrés oxidativo podrían ser suficientes para iniciar el proceso apoptótico. Encontramos que las frecuencias de las células apoptóticas se redujeron significativamente con el agua H ₂ . Además, el análisis de citometría de flujo de sangre periférica mostró que el H ₂-el agua redujo significativamente las frecuencias de las células CD14 ⁺ circulantes. Curiosamente, los análisis de secuenciación de ARN identificaron una red transcripcional de respuesta inflamatoria como la función biológica más significativa modulada por H2 _– agua. Suprimió en gran medida las expresiones de genes implicados en la señalización de TLR-NF-κB, como resultado, los niveles de transcripción de citoquinas proinflamatorias disminuyeron significativamente.

Existe una amplia evidencia experimental de que el estrés oxidativo puede alterar la función celular al deformar los ácidos nucleicos ²² ; el daño oxidativo del ADN puede ser citotóxico o mutagénico y se ha relacionado con la patogenia de la enfermedad ²³ . Una de las formas más predominantes de lesión del ADN endógeno es la 8-OHdG, que se forma por la adición de un radical hidroxilo a la desoxiguanosina ²⁴ . Por lo tanto, la 8-OHdG se ha utilizado ampliamente como un sello distintivo del estrés oxidativo y los niveles elevados de 8-OHdG podrían ser un factor de riesgo para el cáncer, la aterosclerosis y los diabéticos ^25.. Es de destacar que la concentración de 8-OHdG disminuyó al 35% de los niveles de referencia en el grupo HW, aunque no se encontró significación debido a la reducción del 52% en el grupo PW también. Ishibashi y col . También observaron que los pacientes con artritis reumatoide mostraron una reducción significativa en los niveles de 8-OHdG urinario después de la ingesta de 530 mL / d de agua H ₂ durante 4 semanas ¹⁷ . Se ha demostrado que el agua hidrogenada reduce la oxidación del ADN en estudios de modelos animales. H ₂ de tratamiento de agua rica en a ratas inhibe un aumento dependiente de la edad en los niveles de suero de 8-OHdG ²⁶ . El efecto protector del H ₂contra la lesión oxidativa del ADN también se incrementó en un modelo de conejo de osteonecrosis inducida por esteroides, como se reveló al cuantificar las células hematopoyéticas positivas para 8-OHdG [ ^27] . De manera similar, una inyección intraperitoneal de H ₂ salina en ratas fue eficaz en la disminución del número de células del miocardio 8-OHdG-positivas después de la inducción de la lesión cardiaca I / R ²⁸ . Una posible explicación mecanicista del efecto supresor de HW sobre la producción de 8-OHdG es que el hidrógeno inerte reacciona con el radical hidroxilo ⁹ . Sin embargo, se necesitan más estudios mecanicistas para identificar si existe una interacción directa entre el radical hidroxilo y el hidrógeno cuando se administra hidrógeno molecular a través de la ingestión oral de H2 _.-agua rica. A diferencia de 8-OHdG, muchas moléculas variadas están involucradas en la peroxidación de lípidos, incluyendo peroxi, alcoxi, radicales alquilo, ozono y dióxido de azufre, así como el radical hidroxilo ²³ . Se sabe que H ₂ elimina selectivamente los radicales hidroxilo sin afectar a otros ROS ²⁹ ; por tanto, no es sorprendente que no se hayan observado cambios en los d-ROM durante la intervención.

El envejecimiento se caracteriza generalmente por un estado en el que se eleva el estrés oxidativo sistémico y / o se altera el sistema de defensa antioxidante, lo que indica una desregulación del equilibrio redox y la acumulación de daños oxidativos ³⁰ . Por lo tanto, asumimos que los efectos del agua H ₂ podrían variar con la edad de los participantes. Aunque no hubo diferencia en el potencial antioxidante biológico sérico entre los grupos de intervención y placebo en la población en su conjunto, la estratificación por edad mostró un aumento significativo en la capacidad antioxidante en el grupo de mayor edad ≥ 30 años. El grupo de edad más joven (<30 años) no mostró diferencias entre los grupos de agua H ₂ y placebo. Este hallazgo implica que H ₂-el agua podría ejercer más beneficios de promoción de la capacidad antioxidante en los adultos mayores que en los jóvenes.

La apoptosis es una de las consecuencias derivadas de la generación excesiva de ROS ³¹ . Como la cadena respiratoria mitocondrial es la principal fuente de ROS endógenos, el ADN, las proteínas y los lípidos mitocondriales son susceptibles al ataque de ROS, y estos daños biomoleculares más allá de la capacidad de reparación pueden conducir a la muerte celular programada ³² . La destrucción excesiva de células normales constituye una de las principales causas del envejecimiento ³³ , diabetes ³⁴ y enfermedades neurodegenerativas ³⁵. Sorprendentemente, el grupo HW mostró un porcentaje más bajo en PBMC apoptóticas en la semana 4 en comparación con el grupo PW. Esto sugirió que el consumo de HW fue eficaz para prevenir daños celulares graves. Debido a que las moléculas de hidrógeno tienen un tamaño pequeño y un peso molecular lo suficientemente bajo como para difundirse a través de la membrana celular y entrar en los compartimentos intracelulares, el H ₂ puede haber suprimido directamente estos daños graves ³⁶ . La función anti-apoptótica de H ₂ Se ha informado por otros en estudios en modelos animales tales como la isquemia / ratas inducidas por reperfusión ³⁷ ratas y la hipoxia-isquemia ³⁸. Además, un estudio en humanos de un ensayo clínico no controlado en pacientes con síndrome metabólico potencial demostró un efecto antiapoptótico del consumo de HW en las células endoteliales ¹⁶ . La disminución de la apoptosis en el presente estudio puede haberse relacionado con la disminución de la frecuencia de PBMC positivas para CD14. CD14 se expresa principalmente en la superficie de los monocitos circulantes humanos ³⁹ . Las células sometidas a estrés oxidativo inducen a los monocitos CD14 ⁺ a migrar a su alrededor para el aclaramiento celular apoptótico ⁴⁰ , y los monocitos reclutados fagocitan con éxito las células moribundas ⁴¹ . Por lo tanto, el alivio del estrés oxidativo resultó en una disminución del daño celular, lo que, a su vez, disminuyó la frecuencia de los monocitos circulantes.

El estrés oxidativo y la inflamación están estrechamente relacionados entre sí. Las células inmunes son estimuladas por las biomoléculas dañadas por ROS para promover una respuesta inflamatoria ^3 , 4 . Algunas ROS activan directamente proteínas sensibles a redox y factores de transcripción, incluida la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y NF-κB. También desencadenan la producción de citocinas proinflamatorias, incluidas IL-1 e IL-6 ^42 , 43 . Las células inflamatorias generan ROS, lo que mejora aún más estas respuestas. Los radicales hidroxilo actúan como un mensajero fuerte para la activación de NF-κB, que es fundamental en la inflamación, por lo que la captación de radicales contribuye a los efectos antiinflamatorios ⁴⁴ . Como se muestra en el presente estudio, H ₂-el consumo de agua regulaba notablemente a la baja la vía de señalización NF-κB. El H ₂ también suprimió los genes regulados por NF-κB en el hígado de ratón sano [ ^45] . En estudios en animales con modelos de inflamación, la administración _de H2 disminuyó eficazmente los niveles de citocinas proinflamatorias como IL-1, IL-6 y TNF-α ^{46 , 47 , 48 , 49} . Además, se ha informado que el H ₂ genera fosfolípidos modificados, un antagonista de los fosfolípidos oxidados, lo que resulta en una disminución en la señalización de Ca ²⁺ y el Ca ²⁺Vía del factor nuclear dependiente de células T activadas (NFAT) que induce la producción de citocinas proinflamatorias ⁵⁰ .

En el presente estudio, todos los participantes consumieron diariamente 1,5 L de agua, tanto si estaban en el grupo de intervención como en el de placebo. Basado en los registros personales de un individuo sobre la ingesta habitual de agua que se analizó antes de participar, este estudio de intervención llevó a los participantes a beber 300 ml más de agua en promedio en comparación con su ingesta habitual. Por lo tanto, este incremento en la ingesta de agua podría generar efectos beneficiosos sobre la fisiología del sistema inmunológico, lo que podría atribuirse a la observación de que la capacidad biológica antioxidante se mejoró y el daño oxidativo del ADN se redujo incluso con agua pura. Algunas limitaciones del estudio incluyen una intervención relativamente a corto plazo, y por lo tanto los resultados no pueden abordar el efecto a largo plazo de H ₂-agua. Además, los participantes del estudio se reclutaron en su mayoría de la Universidad Nacional de Seúl y de residentes locales y, por lo tanto, es posible que no sean representativos de la población general de adultos sanos. Finalmente, el número de la población de estudio puede no haber sido lo suficientemente grande como para producir una diferencia significativa en los marcadores de estrés oxidativo en sangre.

En conclusión, este trabajo presenta, hasta donde sabemos, el primer estudio integral doble ciego controlado con placebo que investiga los efectos del agua H ₂ en adultos sanos. La ingesta de 1,5 L de agua H ₂ durante 4 semanas redujo la muerte celular y las respuestas inflamatorias al modular las redes transcripcionales de la señalización de TLR-NFκB. Además, puede promover la capacidad antioxidante biológica en adultos> 30 años más que en individuos más jóvenes.

ENLACE A LA REVISTA NATURE: https://www.nature.com/articles/s41598-020-68930-2

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